当日までに用意しておくもの
1.SP2を10日前に起こしておく。Confluentにならないように薄めで蒔く
使用するSP2は40〜50％confluentで8枚／匹
2.マウスはboosterをかけてから３、４日経過したもの（もっとも多くのリンパ球が取れる）
3.ハサミ、ピンセット（オートクレーブ済） ３セット
4.発砲スチロール（マウス固定用）
方法
1. SP２をserum free mediumでピペッティングして50mlチューブに集める。
2. CF 1200rpm （マウスの処理が終わるまで遠心し続ける）
3. マウス処理
1. 50ml falconにガーゼを入れ、ジエチルエーテルを染み込ませる
2. 袋の中にジエチルエーテルを染み込ませたガーゼをいれ、マウスを眠らせる。
3. 10cmDishにserum free mediumを10ml入れておく。
4. 眠ったマウスを発砲スチロールに固定する。
5. マウスが起きださないように1.で用意したチューブをマウスの顔のところにおいておく。
6. マウスの腹部にハサミを入れ、胸部に向けてきり、外皮をはがしていく。
7. 腹膜と外皮をはがし、腕のところにくぼみを作り、腋下静脈をはさみできる。
8. するとすぐに血液が流れでるので、それを1mlピペットで吸い取り、1.5mlチューブに入れる。（37℃一時間、4℃O/Nし、血清を得る）
9. 血液を回収したマウスは死ぬのでもう麻酔の必要はない。
10. 脾臓を回収する。
11. 2回serum free mediumで洗う
12. 18Gの注射針を用意し、針の半分のところで垂直に曲げる。
13. 脾臓の先端を切り取り、脾臓をピンセットで押さえ、12で作った針を使って、
脾細胞を押し出す。
14. ピペッティングを行い、きちんと細胞をほぐす。
15. メッシュを50ml falconにセットして細胞をこす。
16. CF 1200rpm 10min
4. CFが終わったら、SP2を1本のチューブにまとめる。
5. 脾細胞、SP2細胞と一緒にCF1200rpm 10min
6. アスピレート、タッピング 30ml serum free medium
7. CF1200rpm 10min
8. SP2細胞アスピレート、タッピング 30ml serum free mediumを加え、count
9. SP2:spleen cell=1:10程度になるようにspleen cellのペレットにSP2細胞懸濁液を加える。Serum free mediumで30mlになるようにメスアップする。
10. CF 1200rpm 10min（30ml程度mediaを暖めておく）
11. アスピレート、ペレットの周りは線維芽細胞なのでよく吸いとる。
12. アスピレートした状態で（mediumなしの状態）で、CF 1200rpm 10min
（＊PEGの準備をする、ビンを熱湯で熱し、溶かしたら、37℃のSerum free mediumを加え、50％PEGにする）
13. アスピレート
14. PEGを0.5mlとり、チューブの壁につけながら1分かけて加える。
15. 37℃Serum free medium 1mlを1分かけて加える。
16. 37℃Serum free medium 7mlを3分かけて加える。
17. 37℃Serum free medium 1.5mlを加える。
18. CF 2200rpm 5min
19. ペレットを確認し、赤血球が壊されていることを確認する（ピンクになっている）
20. 10cmdishに20％FCS Mediumを10mlいれ、10mlピペットの先端でペレットをできるだけ壊さないように（塊のまま）取り出し、静かにdishの中央に置く。
21. 顕微鏡で観察する（細胞が雪だるま状（ミッキーマウスも有り）になっていたら成功）
22. 37℃でincubateし、hybridomaの形成を促す。
23. ３時間以上経過したらHAT solutionを作製する
24. dishをピペッティングし、50mlチューブに集める
25. HATmediumを10mldishに加え、もう一度集める
26. CF 1200rpm 10min（この間に96穴プレート10枚、リザーバーを用意する）
27. アスピレート、タッピング
28. HAT solution mediumを10ml加え、懸濁する
29. HAT solution mediumを10ml加え、懸濁する
30. 50mlチューブ2本に10mlずつそれぞれ加え、50mlにメスアップする
31. 100μｌ/1wellずつ分注する
32. 翌日HAT mediaを1wellに100ulずつ加える。
33. 2.3日後にmedium change
34. 以降はそのままincubate |
